康信视点 | 生物标志物专利申请：筛选实验还不够，验证实验为何至关重要？

作者 | 李海霞

作者 | 李海霞  北京康信知识产权代理有限责任公司

编辑 | 布鲁斯

从“发现关联”到“证明能够诊断”，中间还隔着关键的一步——验证实验。

一、为什么筛选实验还不够？

生物标志物是能够被客观测量和评价，并可反映生理或病理过程以及对治疗干预产生的生物学效应的指标，广泛应用于疾病筛查、诊断、临床研究、指导用药和预后判断等领域。

对于疾病生物标志物相关专利申请，通常需要记载与疾病相关的生物标志物的筛选和验证过程。

筛选实验通常基于疾病组与对照组之间基因、蛋白等物质的表达差异，获得可能与疾病相关的候选标志物。但筛选实验一般只能揭示标志物与疾病之间存在统计学关联，尚不足以证明该物质能够有效用于疾病诊断，也就是能否较为准确地区分患病受试者和未患病受试者。

因此，对于生物标志物的疾病诊断应用，通常还需要进行相应的验证实验。验证实验的目的在于使本领域技术人员能够确信：

该物质不仅与疾病存在关联，而且确实具有用于诊断该疾病的价值，能够达到相应的灵敏度和特异性。

从专利法角度看，验证实验的缺失可能引发两类问题：

• 说明书未充分公开如何实现相关诊断用途，可能不符合《专利法》第26条第3款；

• 权利要求所概括的诊断用途缺乏说明书公开内容的充分支持，可能不符合《专利法》第26条第4款。

通常而言，说明书应当提供验证生物标志物灵敏度、特异性的实验数据，或者其他足以证明其诊断价值的实验数据，使本领域技术人员能够基于说明书公开的内容，合理得出该生物标志物可以用于相关疾病诊断的结论。

如果说明书缺少足以证明生物标志物诊断价值的实验，其既可能难以满足充分公开的要求，也可能导致相关权利要求得不到说明书支持。

二、筛选实验与验证实验有什么不同？

（一）筛选实验：完成靶点关联性初筛

筛选实验一般通过基因测序、蛋白定量等方式，对比不同来源样本中的标志物表达差异，其主要价值是发现标志物在患病样本与对照样本之间存在统计学差异。

筛选实验能够帮助研究人员锁定候选生物标志物，但通常还不足以量化其诊断效能。如果权利要求进一步覆盖“诊断疾病”等用途，仅有筛选实验可能不足以证明相关诊断用途能够实现，也可能不足以支撑相应的权利要求范围。

（二）验证实验：证明候选标志物的诊断价值

验证实验是判断候选标志物能否实际用于疾病诊断的重要环节，通常依托经临床参考标准确认的患病受试者组和未患病对照组样本开展。

例如，可以对受试者进行盲测，并将标志物检测结果与临床参考标准进行比较，从而考察该标志物的灵敏度和特异性。

• 灵敏度是指患病者中被正确检出为阳性的比例，也称真阳性率，反映标志物识别患病者、减少漏诊的能力；

• 特异性是指未患病者中被正确检出为阴性的比例，也称真阴性率，反映标志物排除未患病者、减少误诊的能力。

计算公式如下：

其中：

为了进一步评价标志物的诊断效能，通常还可以在不同截断值（Cutoff）下分别计算灵敏度和“1－特异性”，以灵敏度为纵轴、“1－特异性”为横轴绘制ROC曲线，并计算曲线下面积（AUC）。

作为一种常见的粗略评价方式，AUC小于0.7时区分能力相对较低；AUC在0.7至0.9之间时具有一定区分能力；AUC达到或超过0.9时区分能力通常较高。具体评价仍应结合疾病特点、检测用途、样本构成等因素进行判断。

三、案例实证：缺少验证实验可能带来什么后果？

案例一：膜结合蛋白标志物在转移性癌症诊断中的应用

说明书针对多个癌症种类开展了配对细胞实验，设置转移性和非转移性对照细胞株，并借助蛋白印迹、流式细胞术等手段，在细胞及细胞外囊泡层面证明目标膜结合蛋白的表达水平与肿瘤细胞转移能力之间存在关联，完成了候选标志物的关联性筛选。

说明书未采用经临床参考标准确认的患病组和对照组样本，也未提供TP、TN、FP、FN等统计数据以及灵敏度、特异性等实验结果，因而缺少足以证明该生物标志物具有相应诊断价值的验证实验。

在实质审查中，审查员认为，本申请缺少足以验证该生物标志物诊断价值的实验。本领域技术人员按照说明书记载的内容并结合现有技术，无法确信相关技术方案能够解决申请所述的技术问题。

因此，该申请被认定为说明书公开不充分，不符合《专利法》第26条第3款的规定。

案例二：基因甲基化标志物在肝癌诊断中的应用

说明书对肝癌、非癌性疾病及健康样品中的基因甲基化水平进行了差异性分析，以证明相关基因甲基化水平与肝癌之间存在关联。

针对肝癌，说明书还开展了部分验证实验：在9例经病理确诊的肝癌样本中，有7例被检出为阳性，即在该组样本中获得了约77.8%的阳性检出率，另外2例未检出阳性。

上述实验可以在一定程度上反映阳性检出情况，但说明书披露的正常人或其他阴性参照数据，不足以确定特定判定标准下的真阴性数、假阳性数和特异性，也不足以证明假阳性率处于合理范围。

因此，仅凭这些信息，仍难以得出该基因甲基化水平可以有效区分肝癌患者和正常人的结论。

本案一审判决指出，判断相关标志物能否用于诊断肝癌，需要考察其能否将肝癌患者与正常人相互区分。肝癌诊断既要考虑灵敏度，即阳性检出情况和假阴性问题，也要考虑特异性，即阴性检出情况和假阳性问题。

本专利的实施例证明，在9例肝癌患者中可以通过基因甲基化水平检出7例，具有一定的阳性检出能力；相关附图也显示，肝癌患者的甲基化百分比高于正常人。但这些信息不足以证明假阳性率处于合理范围，也不足以证明该标志物能够同时满足相应的灵敏度和特异性要求。

最终，权利要求中要求保护的“用于诊断肝癌”的相关技术方案被认定得不到说明书支持，不符合《专利法》第26条第4款的规定。

四、同样缺少验证实验，为何法律后果不同？

从上述两个案例可以看出，验证实验的缺失可能引发不同的法律后果。

案例一完全缺少与相关诊断用途相对应的验证数据，被认定为说明书公开不充分，违反《专利法》第26条第3款；案例二虽然提供了一定的阳性检出数据，但不足以证明诊断特异性，最终被认定为相关权利要求得不到说明书支持，违反《专利法》第26条第4款。

这两个案例表明，验证实验的缺失既可能影响说明书是否充分公开，也可能影响权利要求是否得到说明书支持。

第26条第3款与第4款相互关联，但关注的问题有所不同：前者主要考察本领域技术人员能否根据说明书实现发明，后者主要考察权利要求所概括的范围是否与说明书公开的内容及其技术贡献相匹配。在具体案件中，二者可能基于相近的事实分别适用。

五、申请后再补交实验数据，来得及吗？

实践中，部分申请人会在收到审查意见后，通过补交验证数据的方式弥补原始说明书的不足。

随着《专利审查指南》的修订，中国专利审查对于申请日后补交实验数据的接受尺度有所调整。但这并不意味着所有补交数据都能被采纳。

根据现行审查标准，补交实验数据所证明的技术效果，应当是本领域技术人员能够从原申请公开内容中得到的技术效果。如果原说明书完全缺少灵敏度、特异性等验证实验的记载，仅披露了筛选实验所显示的关联性，后续补交的诊断验证数据仍可能无法弥补申请日时已经存在的公开或支持缺陷。

因此，无论涉及第26条第3款还是第4款，过度依赖申请日后补交数据都存在较高风险。

六、实务建议：验证数据应尽可能写进原始说明书

从降低专利申请和后续无效风险的角度出发，较为稳妥的做法是：在撰写专利申请文件之初，就尽可能将必要的验证实验数据纳入说明书。

具体而言，可以重点关注以下内容：

1. 依托经临床参考标准确认的患病组和对照组样本开展验证；

2. 尽可能完整呈现真阳性、假阴性、真阴性和假阳性数据；

3. 根据实验结果计算灵敏度和特异性；

4. 在适当情况下绘制ROC曲线并计算AUC；

5. 清楚记载样本来源、入组标准、排除标准和检测判定标准；

6. 确保实验所验证的疾病、样本类型、检测方法和用途与权利要求范围相匹配。

通过较为完整的验证数据，可以帮助本领域技术人员确认该生物标志物确实具有相应的疾病诊断价值，而不是仅停留在筛选阶段的关联性发现。

这些做法既有助于满足说明书充分公开的要求，也有助于确保权利要求所限定的诊断用途得到说明书支持，从而降低专利申请被驳回或授权后被宣告无效的风险。

结语

对于疾病诊断类生物标志物专利而言，筛选实验解决的是“它是否可能与疾病有关”，验证实验回答的则是“它是否真的能够用于诊断”。

从相关案例来看，发现关联只是起点，证明诊断价值才是决定相关专利权利能否稳定的重要一步。

end

（本文仅代表作者观点，不代表知产力立场）

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